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化学的な遺伝子の生産または合成は、現代の分子生物学における重要な柱であり、完全な天然遺伝子および新規遺伝子 (自然には発生しない遺伝子) の生産に役立ちます。さらに、このプロセスはゲノム全体 (生細胞内に存在する遺伝的指示の完全なセット) を生成するための基礎です。
遺伝子合成の進歩により、関係者は多様な遺伝子生産方法を利用できるようになります。ただし、各方法には特定の遺伝子を合成するというニッチな用途があり、ある技術を別の技術に置き換えることはできません。したがって、さまざまなプロジェクトで方法を選択する際の参考となる、一般的な遺伝子合成技術とその特徴の概要を以下に示します。
合成遺伝子生産は、DNA テンプレートに依存せずに遺伝子およびその他の遺伝子産物の生産を促進する段階的なプロセスです。したがって、配列や塩基対が変更されたカスタム遺伝子など、多様な遺伝子の生産が容易になります。
上で述べたように、バイオテクノロジーの進歩は、複数の合成遺伝子生産技術が存在することを意味します。ただし、すべての技術は、化学的遺伝子生産の基礎として生物の天然遺伝子生産プロセスを借用しており、ところどころにわずかな変更が加えられています。
したがって、基本的な遺伝子合成プロセスを理解することは、遺伝子合成技術間のニュアンスを理解するのに役立ちます。以下に、遺伝子合成に含まれる手順の概要を示します。
オリゴヌクレオチドは短い核酸 (DNA または RNA) 鎖であり、ペプチドやタンパク質の合成を含むあらゆる遺伝子産物生成の構成要素として機能します。遺伝子合成法が異なれば、オリゴヌクレオチド合成を開始するために異なる試薬と技術が使用されます。ただし、プロセスはすべての方法で 3 フィートから 5 フィートの方向に進みます。
アニーリングでは、オリゴヌクレオチドなどの分子を加熱してから徐々に冷却し、ハイブリダイゼーションまたは 2 つの分子間の化学結合の形成を促進します。さまざまな遺伝子合成法では、完全な遺伝子配列を形成するために独自の消滅技術が採用されています。
クローニングでは、クローニング ベクターを使用して、新しく形成された遺伝子配列のコピーを複製します。
遺伝子合成は完璧なプロセスではありません。したがって、クローン内の標的遺伝子を同定するにはクローンスクリーニングが必要です。一般的なスクリーニング ツールには、ELISA キットやクロマトグラフィーなどがあります。
標的遺伝子を特定することに加えて、配列内の塩基対を徹底的に分析する必要があります。さらに、塩基の欠失や置換などの複製エラーを修正するための修正手段により、望ましいプラスミドの配置が保証されます。
以下は、最も一般的な遺伝子合成方法とその応用の概要です。
固相合成は古典的な遺伝子合成法であり、ロックド核酸 (LNA) などの化学修飾ヌクレオシドを使用して標的オリゴヌクレオチドを合成します。脱保護酸を含む試薬カラムにはヌクレオシドが保持されており、その後のヌクレオシドの脱保護によりオリゴヌクレオチド鎖が徐々に形成されます。
酵素による組み立てプロセスでは、ヌクレオシドのブロック解除 (脱保護) に続いて、カップリング、キャッピング、および酸化を行って、新しく形成されたオリゴヌクレオチドから遺伝子配列を形成します。固相合成は完全に自動化されたプロセスであり、研究者は最後に遺伝子を収集します。その利点としては、遺伝子配列の精度が非常に高いことが挙げられます。
ただし、脱保護プロセスでは副反応の可能性が増加し、時間が長くなるにつれてリスクも増加します。したがって、固相合成では長さ 15 ～ 25 塩基 (最大 200 ヌクレオチド残基) の遺伝子のみが生成されます。このような遺伝子は、タンパク質合成におけるアンチセンスや相補的遺伝物質を検出するためのプローブなど、分子生物学および医学に応用されています。
チップベースの DNA 合成は、次世代の遺伝子合成プロセスです。化学プロセスである固相合成とは異なり、チップベースの合成は電気化学プロセスです。
この方法では、温度制御機能を備えたマイクロアレイ半導体チップを利用して、1 つの設定内で複数のオリゴヌクレオチドを生成します。チップベースの合成は、仮想ウェル/アイランドと呼ばれる温度制御ゾーンのポケットを作成し、選択性を促進することにより、従来のホスホルアミダイト サイクル化学プロセスを補完します。
さらに、オリゴヌクレオチドの組み立てプロセス中のエラーの検出と修正が容易になり、別個の配列分析やエラー修正の段階が必要ありません。チップベースの合成の利点には、高スループットと、より長い塩基対を持つ遺伝子断片を生成する能力が含まれます。この技術は、大量の標的 DNA と低い精度を必要とするアプリケーション向けの遺伝子配列を生成します。
PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) 遺伝子合成は、プライマーを利用した 2 段階で何百万もの遺伝子断片を生成する古典的なプロセスです。第 1 段階では、自己プライミング連鎖反応によって重複するヌクレオチドを組み立て、配列全体をカバーする 60 bp のオリゴヌクレオチドを生成します。
第二に、その後の PCR 反応により、長さ 400 ～ 500 bp の DNA フラグメントが生成されます。追加のプライマーはターゲット DNA フラグメントを増幅します。この方法は、高精度で長い遺伝子断片が必要なアプリケーションに最適です。
アレイ由来の遺伝子合成は、試薬の消費量が少ないため、おそらく最も手頃な遺伝子生産プロセスです。第二に、この方法は多重化能力に対応し、数千から数万のオリゴヌクレオチド配列を生成します。
ただし、オリゴヌクレオチド配列が多様であることは利点ですが、配列相同性のため、オリゴヌクレオチドを組み立てて実行可能な遺伝子フラグメントにすることは困難です。したがって、この方法は、はるかに少ない量の遺伝子断片を必要とするカスタム遺伝子合成プロセスに最適です。
液相遺伝子合成も古典的な技術であり、多くの要素において固相合成と似ています。ただし、固相合成とは異なり、オリゴヌクレオチドの生成はカラム支持体ではなく溶液中で行われます。また、液相遺伝子合成は側鎖反応のリスクが低く、遅いとはいえエラーを最小限に抑えて長い DNA 断片を生成できます。
遺伝子合成技術は、高品質の遺伝子、コスト効率、拡張性に対する需要の高まりに応えるために絶えず進化しています。上記で強調表示されている方法は主要な遺伝子生産方法であり、プロジェクトと予算に最適な方法についてサービスプロバイダーに相談できます。
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